靶向蛋白质降解（TPD）是一种通过促使E3泛素连接酶与靶向蛋白质接近，从而促进靶向泛素化及其后续的蛋白酶体降解的新兴治疗工具。TPD在处理致病蛋白方面展现了巨大的潜力。其实施方式主要有两种：其一是利用蛋白质降解-靶向嵌合体（PROTACs），这种双功能化合物分别与靶点和E3连接酶结合；其二是通过单价结合分子胶、靶点或连接酶展开作用。本文将专注于一种名为分子内双价粘合剂（Intramolecular Bivalent Glues, IBGs）的新型BRD4双功能降解剂的作用机制，为靶向蛋白质降解提供了一种创新模式。

与PROTACs通过trans构象连接目标蛋白和E3连接酶不同，IBGs通过cis构象同时作用于并连接目标蛋白的两个相邻结构域，增强其与E3连接酶的表面互补性。这种构象的变化利用了目标蛋白与连接酶之间的天然亲和力，将BRD4“粘附”在E3连接酶DCAF16上，从而促进BRD4的降解。而在没有这种化合物的情况下，降解则不会发生。通过对BRD4–IBG1–DCAF16三元复合物的结构解析，研究为更高效的降解剂的合理设计提供了指导，使其效力提升至低皮摩尔级别。

采用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）方法评估BRD4和DCAF16的三元复合物形成情况，该分析使用针对BRD4的铕标记抗体和Cy5标记的DCAF16。如果IBG分子诱导了标记的BRD4与DCAF16之间的三元复合物形成，荧光团之间的距离将足够近以实现荧光共振能量转移（FRET）。因此，激发铕供体荧光团将导致能量转移，并且Cy5受体荧光可以被测量。

在TR-FRET分析中，Cy5标记的DCAF16、His-BRD4及抗His铕标记供体的储备溶液均配制于TR-FRET缓冲液中（50 mM HEPES，pH 7.5，100 mM NaCl，1 mM TCEP，0.05% Tween-20）。进行了两类TR-FRET实验：（1）将IBGs以梯度滴定加入BRD4与Cy5-DCAF16的混合物中进行复合物形成分析；（2）将Cy5-DCAF16滴定加入BRD4或BRD4+IBG中进行复合物稳定性分析。在第一类实验中，IBGs以1:4的比例梯度稀释加入至100 nM BRD4与100 nM Cy5-DCAF16的混合液中，装入白色384孔板中，每孔体积为16 μL。在复合物稳定性实验中，Cy5-DCAF16同样以1:4比例稀释加入，最终BRD4构建体的浓度为200 nM，IBG1浓度为1 μM。保持铕标记抗His抗体和DMSO的浓度分别为2 nM和0.5%。经过反应后在室温下静置30分钟，随后使用PHERAstar FS读板仪读取结果。

本研究首先通过等温滴定量热法（ITC）表征了DCAF16、BRD4与双价分子胶IBG1之间的可能相互作用。观察到IBG1与DCAF16及BRD4 Tandem（包含两个溴结构域BD1和BD2的多肽）形成三元复合物。同时TR-FRET实验显示，在IBG1滴定条件下，BRD4 Tandem与DCAF16之间以剂量依赖性方式形成复合物（EC50=44 nM）。整体来看，IBG1的活性超出了其单价前体JQ1。

进一步的TR-FRET稳定性分析证实，在IBG1存在时，滴定DCAF16至BRD4 Tandem会导致复合物的形成（Kd=712 nM）。值得注意的是，即便不添加IBG1，也检测到DCAF16与BRD4 Tandem存在内在亲和力（Kd=1 μM）。但这种亲和力在孤立的BRD4 BD1或BD4 BD2结构域中并未观察到，表明两者需要协同作用才能形成稳定的复合物。

通过ITC对比分析发现，在IBG1的协助下，DCAF16与BRD4 Tandem之间的亲和力增强（Kd由4 μM降低至0.6 μM），同时相互作用的热力学特性也发生了变化。

在确认IBG1的作用机制后，研究团队进一步合成了新的化合物，以增强其对BRD4和DCAF16的结合活性。新化合物IBG3在降解BRD4方面超过了IBG1，降解效率达低皮摩尔水平（DC50=67 pM）。TR-FRET实验中，IBG3对BRD4–DCAF16复合体的“粘合”能力也显著提升（EC50=32 nM）。

综上所述，通过本文所述的TR-FRET相互作用分析方法，能够有效表征BRD4-DCAF16之间的新型分子胶。这类新型的分子内双价胶通过同时结合目标蛋白的两个结构域，增强其与E3连接酶的亲和力，为靶向多种效应蛋白、重构细胞信号通路、实现有效的蛋白降解以及其他生物医疗应用提供了广阔的前景。

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